module-05｜重对接与相互作用分析：2ITO（gefitinib）与 3POZ（TAK-285）

本模块从 data/cadd-tutorial-inputs 里的 TeachOpenCADD 输入出发，实际完成两个 EGFR 复合物的 重对接、相互作用指纹分析与结构展示，并对"预测位姿 vs 晶体位姿"做诚实对照。

• 运行日期：2026-09-11/12（UTC）
• 上游固定版本：TeachOpenCADD 4efdbd36723b5d07960142e15df393d7c6df2ba1
• 全部产物在本目录：inputs/（输入与中间输入）、scripts/（可复用代码）、outputs/（阶段结果）、 figures/（图组与图版）、logs/（运行日志）、run_module05.sh（复用入口）

1. 先说清楚：本次做了什么、不是什么

这不是数值复现。 引擎与配体准备都不同（Vina/Meeko ≠ Smina/Open Babel）， 相同的打分名与相同的搜索设置不能让两者在数值上等价。因此本报告不引用上游的具体分值， 也不声称与教程逐数值一致；凡涉及 3POZ 重对接的结论，均标记为本课程的扩展。

为透明度，教程未固定的 Vina 随机种子在此固定为 seed 42，并在 outputs/*/screen/summary.json 中记录。

2. 输入身份核对（分析前完成）

两个案例不是同一蛋白构造（一个是 G719S 突变体，一个是野生型），所以它们的口袋与结合模式 不能当作"同一体系换配体"来直接比较。配体的键级/芳香性取自 mmCIF 的化学组分字典 （_chem_comp_atom / _chem_comp_bond），不是从对接程序反推。

本地文件与 RCSB 沉积的一致性（真实核对）

本地包中的 T016/data/3poz.pdb 头部写的是 MDANALYSIS FRAME 0，因此先验证再使用： 与 RCSB 3POZ 沉积按残基号配对、不做叠合比较后——

• 主链 1172 个原子 RMSD = 0.000 Å；CA 293 个 RMSD = 0.000 Å（残基 701–1017）
• 配体 03P 的 38 个重原子 RMSD = 0.000 Å

即：本地文件保留了晶体坐标，只是被 MDAnalysis 重新序列化过（链名改为 X）。 记录见 inputs/provenance_3poz.json。

3. 方法（固定参数，事后未调整）

引擎       Vina 1.2.7（Python 引擎）/ 受体与配体准备 Meeko 0.8.0
打分函数   vina
种子       42                （T015 未固定种子；此处固定并记录）
位姿       10 个              exhaustiveness 8      （沿用 T015 设置）
搜索盒     参考配体重原子包围盒，每侧 padding 2.5 Å
           ≡ 边长 = max−min+5 Å，即 T015 约定
受体       晶体坐标系；去水去硫酸根；Meeko 依模板补氢并赋 Gasteiger 电荷
配体输入   由化学式独立生成 3D 构象（seed 42），与参考位姿无关

受体准备中的一处真实取舍：2ITO 的 988 与 1004 号残基因晶体学无序（激活环/C 端， 990–1001 完全缺失，988/1004 侧链被截断）无法匹配模板，被 Meeko 的 --allow_bad_res 剔除 （logs/ 中保留完整输出）。这两个残基距配体 19 Å 与 15 Å，不在 ATP 口袋内，剔除不影响结合位点； 该事实已在结果中记录而不是隐去。

4. 结果

4.1 位姿找回（"能不能找到实验观测到的位姿"）

两种 RMSD 约定必须分开引用：direct 是图匹配后直接算偏差（redock-rmsd 的约定，不做配体叠合）， best_fit 是对称性感知叠合后的偏差，回答的是另一个问题。

给初学者的说明：对接是在口袋里"试摆"分子；打分是排序规则，不是亲和力。RMSD 是与某个参考 位姿的几何偏差。找回一个晶体位姿只能检验"这一套本地设置"，不能证明亲和力、富集能力或换一个靶点也有效。

图组 1（figures/fig1_pose_recovery.png）：10 个采样位姿各自的 RMSD 阶梯。

4.2 经验打分与实验几何是否一致（对照实验）

用同一套受体与格点给实验位姿本身打分（坐标未改动，已核验最近邻偏差 0.000 Å）：

• 局部最小化是另一次独立计算；其坐标单独保存：outputs/<case>/localmin-export/poses_bondorder.sdf （模板感知导出，见 §6）。本次局部优化只把晶体位姿移动 0.22 / 0.23 Å。 注意：单次局部优化不足以证明晶体位姿是打分函数的局部极小点；这里只报告本次优化及其位移。
• 但在 2ITO 中，打分仍把非天然位姿排在实验位姿之前（差 ~1.2 kcal/mol）。
• 这只能说明打分与实验几何存在分歧，不足以单独判定原因属于采样、打分函数、受体/配体准备， 还是结构模型自身的限制。 本模块不作唯一归因。

图组 2（figures/fig2_score_vs_geometry.png）。经验打分不是亲和力实测值。

4.3 PLIP 相互作用指纹（T016 的原始方法）

对晶体位姿与对接位姿各跑 PLIP 3.0.1。两类输入的配体化学身份核验一致 （InChIKey 与分子量相同，见 outputs/plip_identity.csv），这排除了"配体身份不同"这一项； 但指纹差异同时受位姿几何与准备条件（质子化、水与离子、受体坐标）影响， 不能只归因于构象。

• 两种对接位姿都保留 Met793 铰链氢键与 Leu788 卤键。
• 2ITO 的对接位姿丢失 Asp800 盐桥——这正是它 3.16 Å 偏差的一部分来源。
• 3POZ 的对接位姿把第二个氢键从 Asn842 换成了 Asp855（两者都在配体羟基附近，PLIP 的距离/角度 判据对这点位移很敏感）。

相互作用表的原子是按角色解析的：氢键用 protisdon 决定供/受体归属（例如 Met793 的 749 号是 蛋白供体 N，2438 号才是配体受体），卤键用 don_idx/acc_idx，盐桥用嵌套的 idx 列表。 见 outputs/plip_interactions.csv（含原子编号、类型、距离、角度、坐标）。

图组 3（figures/fig3_plip_fingerprint.png）、图组 4（figures/fig4_residue_contacts.png）。

4.4 与上游教程保存输出的差异（明确区分）

• 上游 T016 的 03P:A:1023 保存结果为 5 疏水 / 1 氢键 / 3 卤键，且原输入还包含 3 个硫酸根位点。
• 我们本次（PLIP 3.0.1）对晶体的准备结果是 5 / 2 / 3，额外识别出一个 Asn842 氢键。
• 因此：本次计数与上游保存输出不一致，我们不把它写成"与原教程指纹完全一致"。
• 一处已知的保留组分差异：我们的晶体复合物保留了晶体水，但没有保留 3 个硫酸根； 此外 PLIP 版本与质子化处理也可能不同。没有证据把多出的氢键归因于某个确定原因，此处仅如实记录差异。
• 我们没有为了对齐旧计数而调参。

5. 结构展示（OmicOS Molecule Viewer + 离线渲染）

交互场景（原生 Molecule Viewer，属于本任务的检查环节，不改坐标）： inputs/prepared/2ito_viewer_overlay.pdb 与 3poz_viewer_overlay.pdb 各含 受体（链 A）＋晶体配体（IRE/03P）＋对接位姿（链 L），三者共用同一受体坐标系。 当前 2ITO 场景已载入（2481 原子 / 2 链 / 2 个 HET 配体）；可交互的口袋与距离命令见本次回复正文的 PyMOL 代码块，由前端在当前会话结束后应用，应用后的画面由使用者复核。

离线渲染用 PyMOL 3.2（scripts/10_render_structural_figures.py），每个案例拆成 A 全局 / B 口袋＋距离 / C 位姿叠合三个焦点，标签尽量少，长说明放进图注：

• figures/structural_raw/{2ito,3poz}_A_global.png　整体与 ATP 位点位置
• figures/structural_raw/{2ito,3poz}_B_pocket.png　口袋放大 + 三处实测距离
• figures/structural_raw/{2ito,3poz}_C_overlay.png　晶体位姿 vs 对接位姿叠合

物理解释与表示一致：晶体配体为 sticks + spheres（真正的球棍），对接位姿为 licorice （细棍）；两者同时用颜色与表示区分，不只依赖颜色。PyMOL 没有 ball+stick 这个表示名， 早期脚本里的 show ball+stick 曾静默失败——已修正并保留每次渲染的 stdout/stderr （logs/10_render_*.log，当前无 Error）。

图中距离已用 PyMOL 独立复测核对（2ITO：2.916 / 3.285 / 3.487 Å；3POZ：2.963 / 3.549 / 3.230 Å）， 与 PLIP 报告的 2.92 / 3.29 / 3.49 与 2.96 / 3.55 / 3.23 一致。

图版：figures/plate_structure_2ito/plate.png、figures/plate_structure_3poz/plate.png、 figures/plate_quantitative/plate.png（各含 plate.pdf 与 caption.md；打包 CLI 的合成结果作为中间产物 保留在 figures/packaged_plates/）。

6. 一处被修正的真实缺陷（保留证据）

第一轮 PLIP 分析把对接配体连显式氢一起写进复合物 PDB。PLIP 随后感知到的是另一个分子： 自由基 SMILES、分子量 422.71（而非 446.90）、InChIKey 不同。那样的对接指纹不是同一配体只换位姿的比较。

• 修正：配体只写重原子（与晶体输入一致），并使用规范 PDB 原子名，让 PLIP/Open Babel 自行判定键级与补氢。
• 修正后，对接与晶体输入的 InChIKey 与分子量完全一致。
• 失败轮报告作为证据保留在 outputs/plip_round1_defect/（含 README），不进入最终对比图。

同类问题也出现在第一版"局部最小化位姿"的导出上（用 obabel 直接做 PDBQT→SDF 丢了氢计数， 得到 [C] 自由基）。修正为模板感知的 pose-export，以晶体配体自身的化学图作模板 （键长几何偏差降到 0.0008 Å），并在导出后核验规范 SMILES / 分子式 / 电荷 / 自由基数 / 手性一致， 才用它计算 RMSD。检查项见 outputs/<case>/score_control_*.json 的 minimised_pose_identity_matches_reference: true。

7. 局限

1. 不是教程数值复现：引擎、准备与 PLIP 版本均不同（见 §1、§4.4）。
2. 两个案例构造不同（G719S 突变体 vs 野生型），不可当作同一体系的平行对照。
3. 经验打分 ≠ 亲和力：全部打分只用于排序；本模块没有 IC50/KD 实测值，也没有活性/诱饵富集实验， 因此不能据此判断活性、选择性或可成药性。
4. 只跑了单一协议、单一种子、每次 10 个位姿：找回失败可能来自采样、打分或准备， 本模块不作唯一归因（§4.2）。
5. 水与硫酸根：晶体复合物保留了晶体水（有/无水报告相同），但未保留 3 个硫酸根； 受体对接时去水去离子。
6. 2ITO 有两处无序残基被剔除（距配体 15–19 Å，不在口袋）。
7. 交互场景的渲染画面由使用者复核；离线结构图是用同一坐标的独立渲染，不是浏览器截图。
8. RMSD 未做配体叠合；direct 与 best_fit 两个约定不可互换引用。

8. 复用入口

./run_module05.sh verify-fresh     # 在新目录、新进程中跑一个小步骤（已验证通过）
./run_module05.sh figures          # 重新生成 fig1–fig4（CJK 字体在运行期解析）
./run_module05.sh all              # 完整链路

可配置项（避免只能在当前机器运行）：

已在全新目录、全新进程验证（run_module05.sh verify-fresh）：

• 依赖顺序在入口中已显式排列： inputs → prepare → receptors → (provenance) → pipeline/scores（逐案例）→ complexes → viewer → plip → figures → render → plates。 受体 PDBQT 在对接之前生成；复合物与 Viewer 叠加文件在 pose-export 之后组装 （因此不会读到尚不存在的位姿，也不会在旧目录里先组装旧位姿）。
• 各子步骤真正接收配置：03_run_pipeline.sh、06_run_plip.sh 与全部 Python 子步骤 均读取 CADD_PY / CADD_SKILL / CADD_MODULE / CADD_BIN，不再写死解释器与技能路径； 缺少前置产物时会给出明确报错（例如提示先运行 receptors 或 complexes）。
• 新输出目录显式复制本次原始输入（CADD_SRC_INPUTS，缺失时再从 RCSB 取）， 不依赖旧阶段输出。
• verify 不再删除用户配置的目录，只写入一个新的 verify_box_<时间戳>/ 子目录。

该次新目录运行的实测结果：

已验证范围仅限上表：准备、受体准备、图表路径与 box 步骤在新目录可复跑。 完整的重对接没有在新目录重跑；本模块报告的对接、打分对照与 PLIP 结果来自本会话的运行 （outputs/），不能把上述小检查等同于"整个入口的对接链路已在新环境验证"。

统计图组也已在新进程中独立重绘：scripts/12_make_stat_figures.py 不依赖交互式内核， 自行从阶段产物重建四张面板的数据表并输出 PNG + PDF + 同名 CSV； CJK 字体在运行期按 CADD_CJK_FONT → 常见系统字体顺序解析（本次解析为 Microsoft YaHei）。 每张图版的 plate.png / plate.pdf / plate.svg 均由同一次渲染产出，保证三份格式对应同一版本； 旧版式遗留的 SVG/清单已移入 figures/deprecated_debug/。

9. 文件索引

数据与许可

TeachOpenCADD 教学材料：Volkamer Lab 及各章作者与贡献者，固定提交 4efdbd36723b5d07960142e15df393d7c6df2ba1，CC BY 4.0。 ChEMBL / PubChem / PDB 数据保留各自数据库条款。本模块的新计算与中文解读为本次会话产出； 底层第三方数据不因本仓库许可而重新授权。