1. RNA 数据准备：让 412 例肿瘤成为可信的分析起点

本章用 Omicos 整理 TCGA-STAD RNA-seq 数据，保留下载快照中的全部合格原发肿瘤。

这一步想知道什么

下载的表达矩阵不能直接分析：数值取过对数吗？行名能被后续方法识别吗？一个患者有没有重复出现？本章把这些问题查清楚，留下可靠的表达数据和样本表——后面每一章都从这里读数据。

可以这样问

按导读准备好输入、新建对话后，发送：

请用 iobrx 处理 iobrx_skill_tutorial/inputs 中的 TCGA-STAD 公开输入
（来源与单位见其中 DATA.md），核对数据尺度后完成数据准备：
还原 counts、计算 TPM、整理样本表、画质控图和 PCA。尽可能保留完整
原发肿瘤队列，正常组织用于质控；不参考其他案例的脚本或结果。
产物保存到 iobrx_skill_tutorial/results/01_rna，用中文解释数据取舍。

Omicos 中的 iobrx Analyst 会从 Skill 中找到处理方法和 harness 入口，调用 count2tpm 完成换算，再整理样本表和绘图。下图展示了实际的 Skill 加载与入口解析：

结果怎么看

先看样本和基因各剩多少。

左图：448 份表达数据中有 412 份原发肿瘤、36 份正常组织。412 份肿瘤恰好来自 412 位不同患者，全部保留；正常组织只用于质控，其中 33 份与肿瘤来自同一患者，不能把它们理解成另外招募的健康人群。右图：60,660 行输入经过重复条目处理、全零基因筛选、注释匹配和同名合并，剩 53,095 个唯一基因名。这些步骤减少的是行，412 列肿瘤没有减少。本次有 135 个基因因缺少有效长度未参与 TPM 换算——运行警告只描述这一步，完整的逐步去留记录在 metadata/gene_flow.csv。

再弄清两份表达矩阵的区别。 这份 Xena GDC 数据的原始数值是 log2(count+1)，所以 Agent 先还原成 counts（原始测序计数），再换算成 TPM——TPM 按基因长度和样本总量校正，让不同样本的表达值可以比较。本章同时交付 TPM 和 log2(TPM+1) 两份矩阵：后续方法要线性 TPM 就用前者，要对数表达就用后者，不能因为看见小数就再取一次对数。

然后看质控图。

三个面板分别展示还原 counts 的总量、检出基因数和零值比例。箱体是中间一半样本的范围，中线是中位数。肿瘤组文库总量中位数约 6,731 万，正常组约 5,863 万；两组有重叠也有差异，这张图不能单独说明差异来自测序、取材还是细胞组成。本次有 5 份肿瘤触发质控规则（文库量或检出基因数偏低），仍保留在分析中——质控标记是线索，不是删除指令。

最后看 PCA 图。 PCA（主成分分析）把上万个基因的变化压缩成少数几个方向，方便一眼看样本分布。

每个点是一份样本，本次取变异最大的 2,000 个基因计算，PC1 和 PC2 分别解释约 13.8% 和 10.5% 的变异。两组分布有差别也有重叠。PCA 只展示变化最大的方向，没有拿"肿瘤/正常"标签训练分类器，不能把某个位置的点直接判为异常。

只看 412 例肿瘤时，各分期和性别在前两个主成分上明显混合。这说明这张二维投影没有区分开这些分组，并不说明分期没有影响——研究生存关联需要第 4 章那样的统计模型。

接下来怎么做

本章产物在 results/01_rna/：表达矩阵在 prepared/（TCGA-STAD.tpm.tumor.parquet 是 53,095×412 的线性 TPM，另有对应的 log 版本），样本表在 metadata/tumor_sample_metadata.csv（412 例中 388 例有分期、385 例有生存资料）。接着做第 2 章签名评分，它直接读取这里的表达矩阵。想先检查数据，可以问："这几份被质控标记的样本，排除前后 PCA 图变化大吗？"

参考：IOBR RNA 数据处理方法；TCGA 胃癌研究，Nature 2014；IOBR 2.0，Cell Reports Methods 2024。输入准备与运行记录见数据与运行说明。