常规画图与简单差异表达：用注释后的数据回答基础问题

1. 这一步在做什么

前三步已经得到一份完成预处理和细胞类型注释的 .h5ad。现在可以直接用它画 UMAP、统计细胞组成，并比较不同组的基因表达。

差异表达（DE）就是比较两组样本中哪些基因表达更高或更低。图可以按细胞展示，但统计时不能把几万个细胞当成几万个独立样本。

注释后的 h5ad
→ 看整体分布
→ 比较细胞组成
→ 在指定细胞类型中比较基因表达

2. 开始前：激活正确的智能体

本页使用 OmicVerse scRNA DE & Plotting。简单说，它是注释后单细胞数据的常规分析和作图助手。

你只要说清楚三件事：看哪类细胞、按什么分组、想比较谁和谁。它会先检查数据和样本设计是否够用，再做汇总、比较和作图。

打开“智能体”页面，找到 OmicVerse scRNA DE & Plotting 并点击“激活”。点击可查看原图。

它能做什么

检查 sample、donor、分组和细胞类型标签是否完整；
使用数据中已有的 UMAP 或 PCA，按细胞类型、样本、批次、分组或基因表达着色；
汇总指定基因的表达，并寻找某类细胞的 marker，也就是标志基因；
比较不同样本中的细胞数量和细胞比例；
在指定细胞类型中做简单组间差异表达；
在 counts、样本信息和重复数满足要求时，把同一样本的表达汇总后再比较，也就是 pseudobulk；
输出结果表、作图数据、图片和简短报告。

常见能画的图

你想看什么	可以画什么
细胞整体分布	UMAP、PCA、分面图、指定群体高亮图、基因表达 UMAP
基因和 marker	小提琴图、表达气泡图（dotplot）、marker 气泡图、marker 热图
样本间表达差异	样本级箱线散点图、火山图、样本 PCA、差异基因热图
多种细胞的差异方向	细胞类型 × 基因效应热图、气泡图、效应量森林图
细胞组成	堆叠比例图、样本级比例箱线散点图、覆盖度热图、效应量森林图、配对连线图（仅限配对设计）
数据与设计检查	各样本细胞数、metadata 缺失情况、样本 × 细胞类型覆盖度热图

“样本级”表示图上的每个点代表一个 sample 或 donor，而不是一个细胞。做组间比较时，这一点很重要。

选择	适合什么情况
OmicVerse scRNA DE & Plotting	已经完成预处理，任务也很明确；本案例使用它
Vertical Agent Selector	不确定选谁时自动导航；它本身不执行分析

任务已经明确时，建议手动激活对应智能体。这样更直接，也更容易确认能力边界。

这个智能体可以汇总已有 QC 指标，但不会重新过滤细胞，也不负责去批次、聚类或细胞注释。轨迹、RNA velocity、细胞通讯、CNV、空间分析，以及复杂的多因素或纵向模型，需要交给其他智能体。代谢状态、基因模块和通路富集也不属于本页这个智能体。

最后记住：能画图，不等于能下统计结论。 如果缺少可靠的 sample / donor 标签、原始 counts 或足够的生物学重复，它只能做描述性展示。

3. 直接看一个真实案例

这个案例沿用上一页的注释结果。

项目	本案例
输入规模	141,871 个细胞 × 19,888 个基因
细胞类型列	`cell_type_pro_primary`，8 个细胞大类
已有坐标	`X_umap`
样本信息	6 个组织、28 个 donor、65 个 sample
表达数据	`layers/counts` 中有整数 counts

同一份数据可以继续回答三个问题。

3.1 先看整体图谱

可以直接告诉 omicOS：

<注释后 h5ad 路径>

请使用 cell_type_pro_primary 作为主要细胞类型，
展示已有 X_umap，并分别按 tissue、region、cohortName 和 donorID 着色。
统计各组织、donor 和 sample 的细胞数及细胞类型构成。
本次只做描述性汇总，不做差异推断。

按 cell_type_pro_primary 着色的真实 UMAP。UMAP 是展示图，不是统计检验；点击可查看原图。

这次运行生成了细胞类型、组织、region、cohort 和 donor UMAP，以及细胞数和组成表。最重要的是先确认：

图中是否包含全部 141,871 个细胞；
8 个细胞大类是否都出现；
某个区域是否被单一组织、sample 或 donor 主导。

3.2 再比较细胞组成

如果想比较不同组织中的细胞比例，可以继续问：

请比较不同 tissue 的主要细胞组成，
细胞类型列使用 cell_type_pro_primary。
先建立 donor × tissue × cell type 的完整计数和比例表。
统计时以 donorID 为独立样本，不能把单个细胞当作重复。
请报告每组 donor 数、效应量和多重检验校正结果。

每个点代表一个 donor。Thymus 的点仍展示，但不计入本次总体检验。先看组内有几个点、离散程度多大，再看检验结果；图较宽时可点击查看原图。

本案例中，Thymus 只有 2 个 donor，因此没有进入探索性总体检验。其余 26 个 donor 用于 5 个组织的总体比较。

结果显示 7 个细胞大类的总体比较通过 BH 多重校正，Mast 没有通过。BH 校正就是在同时检验多个细胞类型时减少误报。

但这里有一个关键限制：tissue、cohortName 和 datasetID 完全混杂。因此只能写成“探索性的组织 / 队列 / 数据集关联”，不能写成纯组织效应。

3.3 最后做简单表达比较

这个案例只看 Ureter 中的 TILC，并比较 Male 与 Female：

请只分析 tissue == "Ureter"
且 cell_type_pro_primary == "TILC" 的细胞。

比较 Male 与 Female，效应方向固定为 Male minus Female。
以 donorID 为生物学单位，以 sampleID 聚合 pseudobulk。
先检查 counts、每个样本的细胞数、library size、基因过滤、
样本 PCA 和相关性。本次先报告描述性 log2FC，
不要退回细胞级 Wilcoxon，也不要把结果称为显著差异基因。

pseudobulk 的意思是：先把同一个样本、同一种细胞的 counts 加起来，再以样本为单位比较。这样不会把同一个人的几千个细胞误当成几千个独立重复。

每个点代表一个 donor。图中展示的是绝对 log2FC 较大的基因和样本分布，不是“显著基因”清单；点击可查看原图。

本次筛出 6,856 个细胞、10 个 donor，Male 和 Female 各 5 个。所有样本都通过最低细胞数检查，范围为 38～3,033 个细胞。library size 就是一个样本汇总后的总 counts。

RPS4Y1、DDX3Y、USP9Y 等在 Male 中较高，XIST 在 Female 中较高，方向符合预期。但本次主分析只报告描述性效应，正式 P 值、q 值和 FDR 均为空，因此不能写“发现了显著 DE gene”。FDR 是同时检验很多基因后，对误报率进行校正的指标。

4. omicOS 实际做了什么

问题	本案例的处理
画整体图谱	使用已有 `X_umap`，按细胞类型、组织、cohort 和 donor 着色
汇总数量	统计 tissue、donor、sample 和细胞类型的计数与比例
比较组成	先在 donor 内合并多个 sample，再以 donor 为统计单位
比较表达	确认 `layers/counts`，按 sample 聚合 pseudobulk，并固定比较方向
检查样本	汇总每个 profile 的细胞数、library size、PCA 和相关性
生成交付	输出结果表、PNG / SVG 图片、作图数据和限制说明

原始 .h5ad 保持只读。分析结果写入新的运行目录。

5. 结果应该怎样看

5.1 UMAP：先看分布，不要直接下结论

UMAP 适合看细胞群是否聚在一起、不同标签落在哪里。它不能单独证明批次已经消失，也不能证明两个群在生物学上完全不同。

建议用同一套坐标分别按 cell type、sample、donor、batch 和 condition 着色。某个区域如果几乎只来自一个样本，后续比较就要更谨慎。

5.2 组成图：一个点应该是一个独立样本

只把所有细胞堆在一起算比例，容易让细胞多的样本支配结果。正式比较时，先确认：

一个点代表 sample 还是 donor；
每组到底有几个独立重复；
比例为 0 的组合是否保留；
样本量太少的组是否被排除或单独标记；
condition 是否与批次、队列或数据集混杂。

5.3 表达比较：同时看效应、样本和不确定性

log2FC 告诉你表达变化的方向和大小。它不等于统计显著。

每个点代表一个 donor。PCA 用来检查样本结构和异常点；点击可查看原图。

先看每组样本数、样本 PCA、离群样本和基因过滤，再看 P 值和 FDR。本案例的 PCA 中，U8 和 U2 位于主体样本之外，其余男女样本仍有混合。因此不宜只根据颜色概括为“按性别清晰分开”。

6. 简单 DE 先确认四件事

要确认什么	人话解释
比较谁和谁	写清实验组、参考组和效应方向，例如 Male minus Female
独立样本是谁	通常是 sample 或 donor，不是单个细胞
counts 在哪里	pseudobulk 需要可靠的原始计数，不能拿任意归一化矩阵代替
设计是否可比较	每组要有足够重复，且 condition 不能与 batch、cohort 完全重合

还要分清两个概念：

marker：某个 cluster 相比其他细胞更有代表性的基因；
condition DE：同一种细胞在两个实验组之间的表达差异。

两者不是一回事。一个好 marker，不一定在 Male 和 Female 之间有差异。

7. 谁负责什么，结果怎样检查

分析者负责	可以交给 omicOS
明确要回答的生物学问题	检查输入是否已预处理、已注释
确认 sample、donor、condition 和参考组	盘点可用列、表达层和已有坐标
判断哪些样本是真正独立重复	按 sample / donor 汇总表达或细胞比例
解释 batch、cohort 和 dataset 的含义	生成常规图、结果表和作图数据
决定离群样本是否排除	标出低覆盖、混杂和能力限制
决定结论能写到什么程度	区分描述性、探索性和样本级推断结果

交付前至少检查：

输入文件是否确实来自前三步；
cell type、sample、donor 和 condition 列是否选对；
图使用的是已有 UMAP，还是重新计算的坐标；
组成比较中的一个点是否真的是一个独立样本；
DE 使用的是 counts 还是 lognorm；
对比方向是否与提示词一致；
每组样本数、离群值和混杂因素是否写清；
图、结果表和文字结论能否互相对上。

8. 下一步

到这里，单细胞分析的基础路线已经走完：整理数据、预处理、注释，再用注释结果回答具体问题。

如果图的数据和统计结果已经确定，但字体、配色、图例或布局还需要调整，可以继续阅读在画布中编辑图片。

如果要继续细分 TILC、Myeloid 或 Epi，可以回到细胞类型注释。通路富集、轨迹、细胞通讯和复杂统计设计需要使用其他专门智能体，不属于本页智能体的能力范围。

想回看完整路线，可以返回单细胞分析导读。

9. 案例实际回放

9.1 在同一项目中新建对话

在“我的项目A”下新建对话，命名为“4-常规画图与简单DE”。

项目用于归档同一个研究，对话用于拆分不同任务。建议把图谱总览、组成比较和表达比较分成独立对话，后面更容易核对输入、参数和结论。

9.2 激活对应智能体

打开“智能体”页面，手动激活 OmicVerse scRNA DE & Plotting。如果不确定，也可以先激活 Vertical Agent Selector 自动导航。

9.3 一次只提一个问题

先发送第 3.1 节的图谱总览提示词。确认细胞数、字段和 UMAP 都正确后，再新建对话进行组成比较或表达比较。

不要把“画十张图、做所有 DE、做富集、做轨迹”塞进同一条提示词。问题越具体，结果越容易检查。

9.4 先核对分析单位

看到计划或首轮检查时，先确认：

任务	应使用的单位
UMAP 展示	细胞
细胞数和比例汇总	sample 或 donor
组成统计检验	donor
pseudobulk 表达比较	sample 聚合，donor 作为生物学重复

单位不对时，先停下来修正，不要等图全部画完。

9.5 打开结果文件

不要只看聊天里的缩略图。至少打开：

主图的 PNG 或 SVG；
图对应的 CSV；
样本数和覆盖度表；
DE 或组成结果表；
报告中的限制说明。

如果图片、数据表和文字使用的分组或样本数不一致，不能直接采用结果。

9.6 记录结论边界

在项目笔记中记录：

输入文件和注释列；
使用的 sample / donor / condition 字段；
比较方向和参考组；
每组独立样本数；
主要图表和结果文件；
结果是描述性、探索性还是样本级推断；
混杂、离群样本和仍需人工确认的问题。

不要只记录“画图完成”或“DE 完成”。

4. 常规画图与简单差异表达