基因调控网络：从 GRNBoost2 候选网络得到 SCENIC regulon

1. 任务说明

完成 CD8 T 亚类注释后，除了“哪些基因表达更高”，还可以进一步寻找：哪些转录因子（TF）可能和一组靶基因共同变化，哪些候选调控程序更偏向某个 cell_subtype。

本案例分两轮完成：

1. 用 GRNBoost2 建立较宽的 TF→target 候选网络；
2. 用 SCENIC 检查候选是否得到 motif 证据支持，并计算每个细胞的 regulon 活性。

这里的箭头表示模型推断的关联，不是实验确认的调控关系。即使通过 motif 剪枝，也不能写成“TF 与靶基因物理结合”或“TF 导致该亚类形成”。

2. 激活 Single-cell GRN Analyst

打开“智能体”页面，激活 Single-cell GRN Analyst。

3. 真实案例：确认输入和分析设计

输入是完成亚类注释的 CD8T_annotated.h5ad：

15 个亚类大小差异很大：最多的 Thymocyte_dev_SOX4 有 1,971 个细胞，最少的 CD8T_ISG 只有 100 个。

3.1 cell、sample 和 donor 不能混用

10,927 个细胞不是 10,927 个独立生物学重复，而且部分亚类与组织高度重合：

因此本页的 RSS 是按细胞亚类得到的描述性特异性分数，没有调整 donor、sample 或 tissue。看到高 RSS 时必须同时考虑组织来源，不能自动解释成亚类内在的调控机制。

4. 实际执行：两句提示词完成两轮分析

4.1 第一轮：GRNBoost2

参考提示词（可直接复制）：请先把尖括号中的内容替换为自己的实际路径。

<CD8T_annotated.h5ad 的完整路径>

请用 GRNBoost2 分析不同 cell_subtype 的调控网络。
告诉我每个亚类可能有哪些关键 TF，并输出表格和图片。

输入的 .X 是包含负值的缩放矩阵，不能用于 GRN；实际运行使用 layers['counts'] 并在模型内部 log1p。

第一轮生成：

1,560 个候选 TF
→ 1,341,320 条 TF→target 候选边
→ 589 个 GRNBoost2 共表达模块
→ 10,927 × 589 AUCell 活性矩阵
→ 15 × 589 RSS 矩阵

4.2 第二轮：在同一对话中继续做 SCENIC

补充参考提示词（可直接复制）

请在刚才的结果上继续做 SCENIC，
并告诉我每个 cell_subtype 有哪些重点 regulon。

本轮直接复用第一轮已验证的 GRNBoost2 边（输入、TF 集合和随机种子一致），随后执行 SCENIC 特有的 motif 剪枝。

4.3 各层结果的含义

4.4 运行中的 fallback 和 warning

5. 结果解读

5.1 输入 UMAP：确认分析范围

确认 15 个 cell_subtype 都进入分析。图中保留了 CD8T_lowqual_mito 和 CD8T_stress_HSP，看到这些群的“特异 TF”时应优先考虑低质量和应激程序。

5.2 GRNBoost2 候选网络

GRNBoost2 得到 1,341,320 条候选边，涉及 1,560 个 TF 和 15,922 个 target；每个 TF 保留 importance 最高的至多 50 个 target，形成 589 个模块（大小 10–50，中位数 24）。importance 只用于排序候选边，不能用来比较两个 TF“谁调控更强”。

5.3 GRNBoost2 RSS 热图

31 个较具亚类特异性的共表达模块。黑框标出各模块最偏向的亚类。RSS 没有 donor-aware p 值。

较容易理解的候选：

5.4 模块活性 UMAP

SOX4、EOMES、TBX21、STAT1 等模块映射回 UMAP。每个面板色标独立，不能凭颜色深浅横向比较两个 TF。

例如 EOMES 模块在效应记忆区域较高、TBX21 模块在 Teff/TEMRA 区域较高，可以写“模块活性分布与注释方向一致”，不能写“EOMES 驱动了这些细胞的命运”。

5.5 SCENIC motif 剪枝

第二轮使用 human hg38 的 cisTarget ranking database 和 motif2TF 表（版本、URL、SHA256 记录在 resource_manifest.json）：

1,341,320 条 GRNBoost2 edges
→ 7,025 个 SCENIC 共表达模块
→ 395 个 motif-supported regulon（保留率 5.62%）
→ 10,927 × 395 AUCell 矩阵
→ 15 × 395 RSS 矩阵

第一轮的 589 个模块与这里的 7,025 个模块构建规则不同，不能用 395 / 589 计算通过率。

5.6 SCENIC RSS：查看亚类偏好的 regulon

热图展示筛选出的亚类相关 regulon 在 15 个亚类中的 RSS。亮色表示描述性特异性较高，不代表 donor-aware 统计显著。先定位感兴趣的亚类，再读取相应 regulon。

motif 剪枝后仍有明确生物学锚点的结果：

CD8T_lowqual_mito 和 MAIT 的 top regulon 以及部分 ZNF/homeobox 候选缺少稳定的生物学锚点，教程保留它们，但不包装成已知主调控因子。

5.7 SCENIC regulon UMAP：警惕稀疏分数

每个面板独立使用 2%–98% 色阶，稀疏分数的少量亮点会被视觉放大。先看非零比例，再做生物学解释。

当 2% 和 98% 分位数都等于 0 时，绘图会自动扩展色阶甚至出现负刻度；原始 AUCell 分数并不小于 0，负刻度只是绘图范围退化。

5.8 两轮结果是逐步收窄，不是独立验证

SCENIC 使用同一份表达数据并复用了第一轮 edges，“两轮都出现”只表示候选经过进一步筛选，不是独立数据或实验的验证。

5.9 主要交付文件

6. 人机职责

omicOS 可以缩小候选范围，但不能替分析者决定“哪个 TF 就是真正的主调控因子”。

7. 验收清单

1. 输入仍是 CD8T_annotated.h5ad，10,927 个细胞、15 个亚类；
2. GRNBoost2 结果写成共表达候选，没有被当作直接结合或因果调控；
3. SCENIC 完成 motif 剪枝，输出 395 个 regulon、AUCell 和 RSS；
4. SPIB(+)、ZNF430(+) 等稀疏分数已被标记，没有仅凭 UMAP 亮点下结论；
5. edges、regulons、AUCell、RSS、资源记录和运行报告都能打开；
6. 结论写成描述性候选，没有把 cell-level RSS 当作 donor-aware 显著性。

8. 下一步

优先复核 ETV7/STAT2/IRF7 的 ISG 程序、EOMES 的效应记忆程序、TBX21 的 Teff/TEMRA 程序和 MTA3 的胸腺相关程序。建议：

1. 打开 regulons.csv，核对 TF 的 target 是否形成一致的生物学程序；
2. 在单一 tissue 或更均衡的数据范围内重复分析，降低混杂；
3. 比较 condition 时，将 AUCell 汇总到 sample/donor 再建立 contrast。

更强的验证需要独立证据，如同一细胞群的 scATAC motif accessibility、TF 扰动、ChIP/CUT&Tag 或独立队列复现。GRN 和 SCENIC 负责提出候选，不负责完成机制证明。

9. 操作回放

1. 新建对话（如“CD8T-GRN-SCENIC”），提供 CD8T_annotated.h5ad 的完整路径。
2. 激活 Single-cell GRN Analyst，不要误选相邻的代谢或扰动智能体。
3. 发送 4.1 节提示词：运行后先看 preflight.json 确认 scaled .X 被排除，再读 REPORT.md 和 edges.csv。
4. 查看第一轮结果：先看亚类 UMAP，再看 RSS 热图，最后用模块活性 UMAP 检查模式是否由少量细胞或应激群推动。
5. 发送 4.2 节 SCENIC 提示词：确认结果明确写出 motif pruning、395 个 regulon 和 edges 复用来源。
6. 按顺序查看第二轮结果：resource_manifest.json → regulon_summary.csv / regulons.csv → aucell_scores.csv → rss.csv → RSS 热图 → regulon UMAP 及非零比例 → run_manifest.json / REPORT.md。
7. 记录交接信息：输入与实际表达矩阵、各层级数量、SCENIC 资源版本和剪枝率、edges 复用来源、warning、重点候选 TF，以及“描述性 RSS”和“motif 支持不等于直接结合”两条边界。