轨迹分析：指定 root 和批次 key 获得 CD8T 伪时间

1. 任务说明

完成 CD8T 亚类注释后，可以进一步问：这些细胞是否沿着某种连续的状态变化排列？轨迹分析把细胞放到计算得到的路径上，并给出每个细胞的伪时间（pseudotime）。

准备带亚类标签的 CD8T h5ad
→ 指定 root
→ 指定批次 key
→ 运行 Single-cell Trajectory Pro V2
→ 选择并检查可复用的轨迹结果

伪时间是细胞状态的相对顺序，不是真实时间。本案例是横断面数据，结果只能作为探索性的状态轴，不能单独证明分化方向或因果关系。

2. 激活 Single-cell Trajectory Pro V2

打开“智能体”页面，激活名称带 Pro V2 的 Single-cell Trajectory Pro V2。

3. 真实案例：确认输入、root 和批次 key

输入是完成亚类注释的 CD8T_Colon_annotated_clean.h5ad：

三个关键字段不要混淆：

• root 是轨迹起点对应的细胞群。本案例选择初始/naive 特征明确的 CD8T_Tn_CCR7（341 个细胞）。root 必须由研究者根据生物学问题指定，工具只能检查它是否存在。
• sampleID 是批次字段的列名，不是某个样本的名字。
• cell_subtype 是着色和复核用的亚类标签列，不能用 sampleID 代替。

4. 发送提示词

参考提示词（可直接复制）：请先把尖括号中的内容替换为自己的实际路径。

<CD8T_Colon_annotated_clean.h5ad 的完整路径>

请对常规 CD8T 做轨迹分析。

亚类标签列：cell_subtype
root：CD8T_Tn_CCR7
批次 key：sampleID

只分析 cell_subtype 以 CD8T_ 开头的细胞。

本次执行中，Pro V2 依次完成了：

1. 检查 cell_subtype、sampleID 和 root 是否存在；
2. 只保留常规 CD8T_* 细胞，排除 432 个 γδ T/MAIT 细胞；
3. 比较批次校正前后的诊断，确认可以使用按 sampleID 校正的结果；
4. 以 CD8T_Tn_CCR7 为方向锚点计算 DDRTree 轨迹和伪时间；
5. 比较候选轨迹，输出推荐结果和视觉对照。

最终轨迹包含 2,059 个细胞、7 个 CD8T 亚类、17 个样本和 5 个供体。

5. 结果解读：按顺序看完整输出

5.1 先看输入：哪些细胞被纳入轨迹

除 7 个常规 `CD8T_` 亚类外，图中还有 MAIT 和两类 γδ T。它们属于不同谱系，因此被排除，最终纳入 2,059 个细胞。*

5.2 主轨迹图：检查伪时间方向

紫色到黄色表示伪时间由低到高。低伪时间细胞位于左侧 root 端，随后沿主干延伸。分支点 1、2 是算法结果，不等于已验证的命运决定点。

5.3 亚类轨迹图：检查起点和状态分布

CD8T_Tn_CCR7 集中在低伪时间端，与指定方向一致；各亚类明显重叠，说明这里更像连续状态变化，而不是互不相干的阶段。

方向一致只说明计算没有把 root 放反，不等于证明 Tn 必然分化为所有末端状态。

5.4 回到原 UMAP：复核伪时间

把伪时间映射回原 UMAP，检查颜色是否大体平滑、低伪时间区域是否与 Tn 位置对应。

DDRTree 和 UMAP 是不同的低维表示，两张图相互复核比只看一条轨迹线更可靠。

5.5 亚类伪时间分布

各亚类伪时间的中位数和分布。

这支持从 Tn 特征较强的低伪时间状态，过渡到记忆、活化和效应特征较强状态的描述；但它不是亚类之间直接祖先—后代关系的证明。CD8T_Tem_CD27 只有 19 个细胞，排序需谨慎。

5.6 marker 动态热图：用基因变化复核方向

颜色是每个基因内部标准化的 z-score，只能比较同一行随伪时间的变化。

可以读出三组主要变化：

• 早期：CCR7、SELL、TCF7、LEF1 等较高，符合 Tn 特征，支持把 CD8T_Tn_CCR7 作为 root；
• 中间：IL7R、ANXA1 及 FOS、JUN、HSPA1A/HSPA1B 阶段性升高（后者也可能反映应激，不能全部解释为分化程序）；
• 晚期：GZMK、EOMES、NKG7、GZMH、GNLY、KLRG1 整体升高，符合记忆/效应程序增强。

ITGA1、CD69、PTPRCAP 等基因并非单调变化，不要为讲出一条直线故事而忽略局部峰值。

5.7 样本着色与批次诊断

多数区域由多个样本共同贡献，没有整条分支只属于一个样本。

样本关联指标由 0.3102 降到 0.0774，亚类关联指标基本不变（0.6419 → 0.6375，保留率 99.3%），因此接受按 sampleID 校正的结果。

这个结果只适用于本次数据，换一份数据要重新看诊断。

5.8 自动选择诊断

Pro V2 自动比较候选复杂度和稳定性，本次选择 45。这是技术检查，不能用来命名细胞状态。

5.9 核心输出文件

6. 候选结果比较：决定使用哪一个

核心运行后，本案例又在 trajectory_parameter_exploration_cd8_only/selected_candidates 中比较了两个候选。

推荐结果：conservative_2branch 保留两个分支点，并与核心运行的排序保持较高一致性。

推荐候选按 cell_subtype 着色。

对照：visual_continuity_1branch 看起来更平滑，但把拓扑压缩为一个分支点。图更平滑不代表证据更强，不作为默认结果。

在 selected_candidates 中重点保留：

核心输出和候选输出是两个不同版本，不要拼接它们的数值表。后续若采用 conservative_2branch.h5ad，marker、通路和条件比较都必须从同一个 h5ad 重新计算。

7. 人机职责

Pro V2 可以给出可复核的排序，但不能把横断面数据变成真实时间序列。

8. 验收清单

1. 输入 h5ad 已完成亚类注释，cell_subtype 不是空列；
2. CD8T_Tn_CCR7 存在且有足够细胞作为 root；
3. sampleID 表示样本/批次，而不是细胞类型或实验条件；
4. 报告写明纳入 2,059 个细胞、排除 432 个 γδ T/MAIT 细胞；
5. 批次校正有前后诊断；
6. root 主要落在低伪时间区域，原 UMAP 伪时间图和 marker 热图方向一致；
7. 推荐结果的 h5ad、图、表和选择说明都能打开，且来自同一候选版本；
8. 结论写成“探索性状态顺序”，没有写成真实时间或已证实的分化路线。

如果报告只给了一张轨迹图，可以继续发送：

补充参考提示词（可直接复制）

请帮我检查这次轨迹结果，
并补充各亚类的伪时间分布、样本分布和 marker 变化图。

9. 下一步

完成本页后，可以继续分析沿伪时间变化的基因、通路或状态模块，或比较不同样本在轨迹上的分布。注意：细胞的伪时间分布是描述性结果，比较实验条件时统计检验应回到 sample 或 donor 层面，不能把每个细胞当成独立生物学重复。

10. 操作回放

1. 新建对话（如“CD8T-轨迹分析”），记录输入 h5ad 的完整路径。
2. 激活 Single-cell Trajectory Pro V2，确认卡片名称含 Pro V2。
3. 发送第 4 节提示词，写清 cell_subtype、root、sampleID，并说明只分析 CD8T_*。
4. 检查核心结果：依次打开伪时间轨迹、亚类轨迹、原 UMAP 伪时间、亚类分布、样本着色、批次诊断和 marker 热图，不要看到主轨迹图就停。
5. 打开 selected_candidates：先看 selection_summary.json，再并排检查推荐双分支图和单分支对照图。
6. 记录本次采用的结果：输入文件、root 及理由、批次 key、纳入/排除细胞数、采用 conservative_2branch、批次诊断、推荐 h5ad 路径，以及“横断面数据，仅作探索性状态轴”的边界。