细胞亚类注释：从 CD8T 聚类得到可复核的亚类标签

1. 任务说明

上一节已经完成 CD8T 谱系内的预处理、降维和聚类。本页给每个 cluster 判断更细的身份：

准备已完成聚类的 CD8T h5ad
→ 指定聚类列
→ 运行细胞注释智能体
→ 结合 marker 复核建议标签
→ 写入 cell_subtype
→ 去除确认的 doublet 和低质量群
→ 得到可用于下游分析的 clean h5ad

注释依据是每个 cluster 的 marker 表达，而不是 UMAP 上的位置。工具给出的是可复核的建议标签，最终是否采用、合并或删除，由分析者决定。

2. 激活 Single-cell Annotator Pro V2

打开“智能体”页面，激活 Single-cell Annotator Pro V2。

如果界面中的名称略有变化，选择说明中明确支持“已聚类 h5ad、marker 证据、可复核亚类注释”的版本。

3. 真实案例：给结肠 CD8T 的 12 个 cluster 命名

输入是上一节交付的 CD8T_Colon_processed.h5ad：

开始注释前只需确认两点：输入文件已经完成聚类，leiden_0p8 中确实有 12 个 cluster。

4. 第一轮：生成建议标签

4.1 发送提示词

参考提示词（可直接复制）：请先把尖括号中的内容替换为自己的实际路径。

<CD8T_Colon_processed.h5ad 的完整路径>

这是已经完成聚类的人结肠 CD8T 数据。
请按照 leiden_0p8 做细胞亚类注释，
给出 marker 证据和图片，并输出带 cell_subtype 的新 h5ad。

路径、聚类列、物种和组织写清楚即可，不需要手动填写 marker 数量、打分阈值等参数。

4.2 主要输出

注释智能体这一轮没有删除任何细胞，疑似 doublet 和低质量群留给分析者复核，这是预期行为。后续分析优先使用短标签列 cell_subtype，它更适合画图、筛选和跨步骤传递。

5. 结果解读：先看证据，再清理问题群

5.1 确认 cluster 与标签的对应关系

注释单位仍是原来的 12 个 cluster。

第一轮注释后得到 12 个短标签：

重点检查 C3 和 C9：分别被标记为低质量和疑似 doublet，而不是普通 CD8T 亚类。

清理前的 UMAP 仍保留 12 类。

这些标签是本案例的工作标签。换成其他组织、疾病或聚类结果后，不能照抄同一套 cluster-to-label 映射。

5.2 用 marker dotplot 复核标签

按行检查：初始样群是否支持 CCR7/SELL/TCF7，效应记忆群是否支持 GZMK，细胞毒群是否支持 GZMH/GNLY，γδ T 是否支持 TRDC/TRGC1/TRGC2，疑似 doublet 是否出现 IGKC/JCHAIN/IGHA。

本轮报告明确记录：12 个 cluster 的候选标签与 marker 证据存在不同程度的冲突或缺口，最终置信度多为中等（C3 为低）。因此这些结果应写成“建议亚类标签”，不能当成已证明的结论。

5.3 第二轮：去除确认的 doublet 和低质量群

人工复核后，本案例决定去除 Doublet_B_IGKC（176 个细胞）和 CD8T_LowQ_PTPRCAP（26 个细胞）：

补充参考提示词（可直接复制）

请去掉 Doublet_B_IGKC 和 CD8T_LowQ_PTPRCAP，
保存为新的 h5ad，并告诉我还剩多少细胞。

删除来自分析者的明确指令，不是智能体自动清除。

清理后保留 2,491 个细胞和 10 个亚类。

最终的 10 个亚类：

合计应为 2,491。数字对不上时先检查筛选条件和写出文件，不要继续做下游分析。

6. 人机职责

可疑群不一定必须删除：Doublet_B_IGKC 可能包含真实的环境 RNA 信号，CD8T_LowQ_PTPRCAP 也可能是稀有状态。是否删除要结合 marker、质量指标和研究目标判断。

7. 验收清单

• [ ] 输入是已完成 CD8T 谱系内聚类的 h5ad，注释使用 leiden_0p8；
• [ ] 第一轮仍为 2,693 个细胞、12 个 cluster，没有被自动删除；
• [ ] 原始 leiden_0p8 保留，新标签写入 cell_subtype；
• [ ] Unknown、低置信度和候选冲突没有被隐藏；
• [ ] 删除 C3、C9 的决定有人工记录，清理后剩 2,491 个细胞、10 个亚类；
• [ ] CD8T_Colon_annotated.h5ad 没有被覆盖，clean 文件能重新读取；
• [ ] 10 个亚类计数之和等于 2,491，UMAP、CSV、h5ad 和报告中的标签互相对应。

“程序运行成功”只说明文件被写出，不代表亚类标签已通过生物学复核。

8. 下一步

本页最终交付 CD8T_Colon_annotated_clean.h5ad（2,491 个细胞、10 个 cell_subtype），可继续用于轨迹、代谢等下游分析。

进入下一篇：轨迹分析：指定 root 和批次 key 获得 CD8T 伪时间。

9. 操作回放

1. 准备输入：确认 CD8T_Colon_processed.h5ad 的路径，且 leiden_0p8 有 12 个 cluster。
2. 激活 Single-cell Annotator Pro V2，注意不要误选只做提示词推荐的免费版。
3. 发送 4.1 节提示词，说明这是已经聚类的人结肠 CD8T 数据，并指定 leiden_0p8。
4. 复核结果：先看 cluster UMAP，再看建议标签、marker dotplot 和证据表，重点记录 Unknown、低置信度和疑似 doublet。
5. 确认短标签：把人工确认的对应关系保存为 cluster_subtype_mapping.csv，写入 cell_subtype，保留原聚类列。
6. 发送 5.3 节清理提示词，要求另存新文件并报告剩余细胞数。
7. 验证交付：重新读取 CD8T_Colon_annotated_clean.h5ad，确认 2,491 个细胞、10 个 cell_subtype，保存计数、映射表和 UMAP 供下一篇复用。