亚类注释前的准备：拆分目标谱系并完成谱系内聚类

1. 任务说明

完成细胞大类注释后，通常要取出某一个大类做更细的亚类注释。本页完成两步：先从大类注释结果中拆出目标谱系，再在谱系内完成预处理、批次整合和聚类。

按 cell_type_pro_primary 拆分 h5ad
→ 选定目标谱系文件（本案例为结肠 CD8T）
→ 预处理、Harmony 批次整合和聚类
→ 得到可交给亚类注释的 h5ad

本案例拆分后得到 8 个 h5ad，再从 majorCluster_CD8T.h5ad 中保留结肠样本，最终得到已完成聚类的 CD8T_Colon_processed.h5ad。

2. 激活 Vertical Agent Selector

打开“智能体”页面，激活 Vertical Agent Selector。

它会判断任务类型并自动转交给合适的执行智能体，不需要手动挑选。

3. 拆分：从大类注释结果中取出 CD8T

输入沿用上游细胞类型注释教程交付的 annotated.h5ad（141,871 个细胞 × 19,888 个基因），大类注释已写入 cell_type_pro_primary。

3.1 发送拆分提示词

参考提示词（可直接复制）：请先把尖括号中的内容替换为自己的实际路径。

<大类注释后的 annotated.h5ad 路径>

请按照 cell_type_pro_primary 把数据拆成不同的 h5ad，
并告诉我每个文件有多少细胞。

3.2 拆分结果

共得到 8 个文件，原文件未被修改，细胞数之和仍为 141,871：

本案例下一步分析 CD8T，使用 majorCluster_CD8T.h5ad。想分析其他谱系时，选对应文件即可（如 CD4T 用 majorCluster_CD4T.h5ad、B 细胞用 majorCluster_B.h5ad）。先选定一个研究目标，不要把 8 个文件全部交给同一轮分析。

3.3 验收检查

至少确认：

1. 原始 annotated.h5ad 没有被覆盖；
2. 8 个文件都能从磁盘重新打开，且每个文件只含一个 cell_type_pro_primary 类别；
3. 每个文件的基因数仍为 19,888，细胞数之和等于 141,871；
4. 样本、供体和表达数据仍然保留。

如果结果只写了“拆分成功”，可以继续追问：

补充参考提示词（可直接复制）

请帮我检查拆分后的 h5ad 是否都能正常打开，
并汇总每个文件的细胞数和基因数。

4. 谱系内预处理：得到 12 个 cluster

拿到 majorCluster_CD8T.h5ad 后还不能直接注释。本案例先按研究问题保留结肠样本（10,942 → 2,693 个细胞），再在 CD8T 谱系内重新完成预处理、批次整合和聚类。

4.1 激活 Single-cell Preprocessor Pro 并发送提示词

新建对话，激活 Single-cell Preprocessor Pro，发送：

参考提示词（可直接复制）：请先把尖括号中的内容替换为自己的实际路径。

<majorCluster_CD8T.h5ad 的完整路径>

这是人类 CD8T 数据。请只保留结肠样本，
使用 sampleID 处理批次，重新做预处理、降维和聚类，
并输出下一步可以做亚类注释的 h5ad 和图片。

批次字段必须写真实的样本列（这里是 sampleID），不能把 cell、donor、dataset 或 tissue 随意当成批次。

4.2 实际执行结果

QC 没有删除任何细胞；基因从 19,888 变为 12,761，是因为只保留了至少在 3 个细胞中检测到的基因。输出 h5ad 中保留 counts、标准化表达、PCA、Harmony 表示、UMAP 和聚类信息。

12 个 cluster 的细胞数：

cluster 6 只有 19 个细胞、cluster 3 只有 26 个。小群可能是真实稀有状态，也可能来自低质量或 doublet，这里只记录，不在注释前删除。

4.3 看图：先批次整合，再聚类和 marker

左：批次校正前；右：Harmony 后按 sampleID 着色。同一区域由多个样本共同贡献，说明批次结构有所减弱。

leiden_0p8 得到 12 个 cluster。UMAP 上分开不等于已经是 12 个真实亚类，命名要结合 marker 复核。

点大小表示表达该基因的细胞比例，颜色表示平均表达。用它确认不同 cluster 有可区分的 marker 模式。

4.4 如实记录 fallback 和重跑

本轮不是一次无警告完成：

• 按 sampleID 做 batch-aware HVG 拟合时数值不稳定，退回到不带 batch key 的 HVG 选择；后续 Harmony 仍正常使用 sampleID；
• 首次交付留下 phase_failed.json，最终使用重跑后的 proc2，其 validation.json 为 valid: true。

“脚本跑完”和“交付通过验证”不是一回事。后续教程使用的是通过验证的 CD8T_Colon_processed.h5ad。

4.5 交给下一步前检查

1. 输入范围确实是结肠 CD8T，2,693 个细胞都进入结果；
2. sampleID 存在（17 个样本），Harmony 状态为 ok；
3. leiden_0p8 含 12 个 cluster，细胞数之和为 2,693；
4. 小 cluster 已记录，没有仅凭 UMAP 删除；
5. 使用的是验证通过的最终重跑结果。

5. 人机职责

拆分和聚类只是整理数据结构，不会自动证明细胞标签正确，也不能替代下一步的 marker 复核。

6. 操作回放

1. 新建拆分对话：新对话不知道上一轮用了哪个文件，需重新提供 annotated.h5ad 路径。
2. 激活 Vertical Agent Selector，发送 3.1 节的提示词。
3. 核对结果：对照 3.2 节的表格，确认 8 个文件齐全、CD8T 文件有 10,942 个细胞。
4. 记录交接信息：拆分字段、8 个输出文件及细胞数、majorCluster_CD8T.h5ad 的完整路径。
5. 新建预处理对话：激活 Single-cell Preprocessor Pro，发送 4.1 节的提示词。先确认 tissue 中代表结肠的实际取值再筛选，不要仅凭文件名猜组织。
6. 查看结果并交接：先看 Harmony 前后对比，再看 cluster 和 marker dotplot。确认 validation.json 通过后，记录 CD8T_Colon_processed.h5ad 的完整路径和聚类列 leiden_0p8。

完成谱系内聚类后，进入下一篇：细胞亚类注释：从 CD8T 聚类得到可复核的亚类标签。

想回看下游路线，可以返回单细胞下游分析导读。