3. TME 反卷积：分清细胞比例和功能分数
本章用 iobrx 对全部 412 例 TCGA-STAD 原发肿瘤运行六种方法。
这一步想知道什么
第 2 章看到免疫相关基因表达有高有低，背后可能是细胞数量不同，也可能是细胞表达状态不同。反卷积借助参考表达或标记基因，从混合的组织表达中估计细胞组成。读这一章的结果，最重要的是先问"这个数字的分母是什么"，再比较患者。
可以这样问
用 iobrx 分析 iobrx_skill_tutorial/results/01_rna 的本次 STAD 肿瘤数据，
完成 CIBERSORT、EPIC、quanTIseq、MCP-counter、ESTIMATE 和 IPS 分析。
尽可能保留全部合格肿瘤，说明各方法
测到的量有什么不同，哪些细胞估计相互支持，哪些结果需要谨慎看待。
不参考其他案例的脚本或结果。产物保存到
iobrx_skill_tutorial/results/03_deconvolution，用中文解读并在对话中
展示关键图和文件链接。
Agent 从 iobrx Skill 中查找各方法的输入要求，通过 harness 完成计算。本章还加做了 quanTIseq tumor=True 和 ESTIMATE 芯片平台两个敏感性对照，共留下八份运行记录。
结果怎么看
先弄清六种方法各在量什么。
| 方法 | 本次输入与设置 | 结果怎样读 |
|---|---|---|
| CIBERSORT | 线性 TPM；LM22；100 次置换 | 22 类参考免疫细胞内部的相对组成，每份样本合计为 1 |
| EPIC | 线性 TPM；TRef | 7 类已定义细胞加未表征部分（otherCells）；细胞比例与 mRNA 比例分开输出 |
| quanTIseq | 线性 TPM；主结果 tumor=False |
10 类免疫细胞加 Other，共 11 列 |
| MCP-counter | log2(TPM+1) | 10 类细胞群的标记丰度分数，同一细胞群可跨患者比较 |
| ESTIMATE | log2(TPM+1)；platform=rnaseq |
免疫、基质及综合表达分数 |
| IPS | 线性 TPM | 多项免疫表型分量及综合分数 |
同样是 0.1，CIBERSORT 和 EPIC 说的不是一回事：前者的分母是参考免疫细胞混合物，后者描述整个样本中被模型识别的细胞及剩余部分。MCP-counter 和 ESTIMATE 连"比例"都不是，不能写成百分数。
再看组成图里的灰色 Other。
每个面板只在一种方法内部比较；柱长是队列均值，点是中位数，线段是第 25–75 百分位。EPIC 的 otherCells 细胞比例中位数为 0.711，7 类已定义细胞合计 0.289；同一模型的 mRNA 比例表则为 0.672 / 0.328——不同细胞的 mRNA 含量不同，两张表不能交换使用。Other 是模型没有细分的部分，可能包含癌细胞，不能当成测得的肿瘤纯度。quanTIseq 把 tumor 改为 True 后，M1 巨噬细胞比例均值从 0.066 变为 0.047，Other 从 0.774 变为 0.800；输出仍是原来的 11 列，使用时写清采用的是哪一套。
然后看哪些细胞估计相互支持。
图左是方法间的 Spearman 秩相关，图右按细胞群汇总。相关描述的是患者排序是否一致，不证明绝对比例准确。本次结果：B 细胞（EPIC–MCP-counter）0.917、成纤维细胞 0.879、内皮细胞 0.855，一致性较强；CD8 T 细胞则看方法——quanTIseq–MCP-counter 为 0.808，CIBERSORT–quanTIseq 为 0.676，而 EPIC–quanTIseq 只有 −0.0003（EPIC 的 CD8 估计约 46% 为零）。遇到分歧不能只保留最符合预期的一种。图中 k 是可比较的方法对数，不是患者数；不同条形用的方法对不同，不能当成统一的准确度排行。
最后看拟合诊断。
CIBERSORT 有 338/412 例置换 P<0.05。这个 P 值比较整体拟合与随机情况，不是某一细胞群的差异检验；100 次置换分辨率有限，输出为零不表示真实概率为零。EPIC 的 412 例均收敛，说明数值求解完成，仍不等于生物学真实性得到验证。检查比例总和前先看列集：CIBERSORT 的 22 列、quanTIseq 含 Other 的 11 列都约为 1，而 EPIC 特意只求和 7 类已定义细胞，因此小于 1。
接下来怎么做
本章 tables/ 分方法保存原表，figures/ 每幅图都有对应 CSV。接着做第 4 章签名与表型：按患者 ID 接上临床资料，看这些特征和分期、生存有没有关系。想先核对，可以问："EPIC 的 CD8 估计为什么近一半是零？换 CIBERSORT 的 CD8 相关细胞看排序变不变。"
两个使用时的提醒：ESTIMATE 的 RNA-seq 主结果没有直接输出 TumorPurity（本次另用芯片平台参数做了诊断对照，但不把它当作这些样本的真实纯度）；当前 iobrx 0.3.1 的 IPS 实际输出范围为 6–13，没有限制在文献常见的 0–10，使用文献阈值前先核对实现与尺度。
参考：IOBR 反卷积方法、CIBERSORT、EPIC、quanTIseq、MCP-counter、ESTIMATE、IPS。文件组织见数据与运行说明。